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子科生物報道：冷凍電子斷層成像（cryo-ET）是在原位環(huán)境下發(fā)現(xiàn)并解析新結構，實現(xiàn)跨尺度生物成像的重要結構生物學手段。近年來cryo-ET領域蓬勃發(fā)展：一方面，cryo-ET數(shù)據(jù)采集及后續(xù)數(shù)據(jù)處理方法的技術革新帶來了分辨率的革命性突破；另一方面，細胞環(huán)境下的目標識別技術及減薄冷凍細胞樣品技術的發(fā)展，使在10萬倍放大倍數(shù)下直接觀察生理條件下細胞內(nèi)的生物學過程成為可能。這兩方面的革新相輔相成，極大地促進了在宿主細胞中原位高分辨觀測病毒活動的研究新方向（圖1），為病毒學研究、藥物疫苗開發(fā)提供了寶貴的原位機制發(fā)現(xiàn)。

2023年5月10日，清華大學生命學院李賽團隊在Annual Review of Biophysics發(fā)表題為《冷凍電子斷層成像的分辨率革命及伴隨涌現(xiàn)的原位病毒學發(fā)現(xiàn)》（Cryo-Electron Tomography: The Resolution Revolution and a Surge of In Situ Virological Discoveries）的綜述文章。該文章系統(tǒng)總結了cryo-ET領域近年來的技術革新、分辨率突破及伴隨其涌現(xiàn)的原位結構病毒學發(fā)現(xiàn)，并對該領域的未來研究進行了展望。

填補空白：cryo-ET填補傳統(tǒng)生物顯微技術的空白地帶

每種生物成像技術都有各自擅長的觀測尺度和對應的分辨率范圍。在傳統(tǒng)結構生物學技術數(shù)十納米的觀測尺度到光學顯微成像技術數(shù)百納米的分辨率之間存在著一個數(shù)量級的“空白地帶”，而cryo-ET技術的觀測尺度及分辨率剛好可以完美填補這一空缺（圖1）。

Cryo-ET技術通過對樣品多個角度拍照獲得傾轉系列（tilt series, TS），將其重構為三維斷層圖像，再使用子斷層平均法（sub-tomogram averaging, STA）進行高分辨率結構解析。相比傳統(tǒng)的冷凍電鏡方法，cryo-ET技術有著優(yōu)秀的層析能力，對樣品純度要求較低，無需使其脫離原生環(huán)境，能最大程度保留生物樣品的自然狀態(tài)。因此對于尺度在100納米左右，結構形態(tài)均一性較差，且難以體外重組表達的囊膜病毒而言，cryo-ET可謂是極佳的研究方法。近5年來，cryo-ET迎來全面發(fā)展，層出不窮的技術革新在不斷拓展其觀測范圍與分辨率極限，使不同尺度生物樣品的原位觀察更加流暢自然。

圖1：Cryo-ET填補傳統(tǒng)顯微及結構生物學技術的空白地帶（Sai Li; Trends in Biochemical Sciences, 2022; 47(2): 173-186）

Cryo-ET的分辨率革命：為原位觀測大分子機器近原子分辨率結構打開嶄新窗口

Cryo-ET面對的生物體系復雜，采集的數(shù)據(jù)規(guī)模龐大，處理起來環(huán)節(jié)繁多。因此，從制樣到采集數(shù)據(jù)，再到結構解析，cryo-ET的工作流程存在多個影響分辨率的因素。這也成為制約cryo-ET分辨率突破的主要原因。本綜述針對當前讓人應接不暇的數(shù)據(jù)處理軟件和流程進行了全面而細致的梳理：分別從前期的數(shù)據(jù)采集、預處理和后期結構計算三個方面，篩選出具有“里程碑”意義的突破性技術，并總結了“冷凍電鏡分辨率革命”以來cryo-ET近十年的技術發(fā)展以及對應的分辨率突破（圖2）。

在前期數(shù)據(jù)采集及處理方面，本文分別總結了最大程度保留數(shù)據(jù)高分辨信息的傾轉系列采集方案，以及提高傾轉系列采集通量的方法學探索歷程，并梳理了針對傾轉系列數(shù)據(jù)特點進行位移校正（motion correction）、襯度傳遞函數(shù)校正（CTF correction）、傾轉系列對齊（tilt-series alignment）以及斷層圖像重構（tomogram reconstruction）在內(nèi)的算法革新。后期結構計算方面，本文總結了利用人工智能輔助顆粒挑選的方法，及Relion 4，Warp & M，EMClarity等軟件在顆粒對齊、分類、平均及循環(huán)糾正等步驟的算法創(chuàng)新。這些數(shù)據(jù)采集方案及處理算法的革新，逐步將cryo-ET的分辨率推進至如今的2-3埃，最終迎來了cryo-ET領域的分辨率革命，從而為原位觀測大分子機器精細結構研究打開嶄新窗口。

圖2：“冷凍電鏡分辨率革命”以來，cryo-ET近十年的分辨率發(fā)展。一系列重要的技術革新，推動了cryo-ET的分辨率革命

眼見為實：一系列原位結構生物學技術的發(fā)展，正將病毒生命周期的“示意圖”轉變?yōu)椤敖Y構現(xiàn)實”

全面了解病毒在宿主體內(nèi)的生命周期是病毒學研究的重中之重，基于此我們才能從中發(fā)現(xiàn)漏洞，篩選靶點，有針對性地開發(fā)抗病毒藥物及抗體。從一顆病毒入侵宿主細胞到大量子代病毒的釋放，病毒在細胞內(nèi)的行為千差萬別，花樣繁多。曾幾何時，我們關于病毒“生命周期”的理解，主要來自于傳統(tǒng)功能學實驗、熒光顯微鏡及常溫切片電鏡觀測。然而，隨著快速投入式冷凍制樣、高壓冷凍制樣、冷凍光電聯(lián)合成像（cryo-CLEM）、電鏡可見的特異性生物標記、冷凍聚焦離子束減薄（cryo-FIB milling）、相位板（VPP）、基于人工智能的圖像識別、降噪和圖形分割等一系列cryo-ET相關技術的發(fā)展，病毒生命周期的“示意圖”正逐步轉變?yōu)椤敖Y構現(xiàn)實”。

本文分別梳理了真核細胞及原核細胞內(nèi)病毒的生命周期，并將其劃分為三個階段：第一階段：病毒入侵宿主細胞，釋放基因組；第二階段：病毒誘導細胞內(nèi)形成復制工廠并進行基因組的大量復制；第三階段：子代病毒組裝成型并脫離宿主細胞開啟新一輪感染。同時，本文詳細歸納了以上病理過程中的重要大分子結構，例如病毒復制工廠的孔道復合物、處于不同進程的病毒組裝中間體以及正在向宿主遞送基因組的噬菌體分子機器等。近五年來，此類研究成果快速涌現(xiàn)，大量不為人知、甚至曾被錯誤理解的病毒活動，終于得到眼見為實的證據(jù)（圖3）。這些發(fā)現(xiàn)為藥物靶點選擇提供了有力的參考信息。

圖3：通過揭示細胞內(nèi)病毒活動的原位機制，cryo-ET正逐步將病毒生命周期的“示意圖”轉變?yōu)椤敖Y構現(xiàn)實”

分辨率革命只是開始：展望Cryo-ET的技術發(fā)展

本綜述不僅對cryo-ET近十年來的技術革新和分辨率發(fā)展進行了細致的梳理，也歸納了cryo-ET揭示的病毒重要原位結構及入侵、復制機制。隨著cryo-ET技術的的不斷發(fā)展，它不僅為微生物領域帶來大量新發(fā)現(xiàn)，也被廣泛應用在神經(jīng)生物學、細胞生物學、植物等領域。

然而，作為一門年輕的技術，cryo-ET領域仍有大量難題亟待解決。首先，相較于傳統(tǒng)的冷凍電鏡單顆粒分析技術，cryo-ET的工作流程整體更加復雜耗時且分辨率較低。本文指出開發(fā)可靈活組合使用的整合工具包將極大提升cryo-ET的工作效率。要提升子斷層平均結構的分辨率需要從低信噪比數(shù)據(jù)中盡量完整有效地提取高頻信息用于計算，這是cryo-ET結構計算領域的一大重要目標。此外，電鏡圖像雖能保留大量高頻信息但其信噪比較低，常常難以鎖定細胞內(nèi)的目標分子。為此，聯(lián)合其他顯微手段，并通過開發(fā)新型樣品特異性標記方式，可以幫助我們在細胞內(nèi)尋找感興趣的生物學事件。