由中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所的高彩霞教授領(lǐng)導(dǎo)的研究人員，與清華大學(xué)的劉俊杰副教授及中國科學(xué)院動物研究所的張勇教授合作，揭示了V型CRISPR-Cas免疫系統(tǒng)起源的分子創(chuàng)新機制。他們于9月29日發(fā)表在《細胞》雜志上的研究結(jié)果表明，源自轉(zhuǎn)座子的RNA發(fā)生功能分裂是驅(qū)動V型CRISPR-Cas免疫系統(tǒng)出現(xiàn)的關(guān)鍵創(chuàng)新。

先前的研究表明，V型Cas12效應(yīng)蛋白的祖先蛋白是由IS200/605轉(zhuǎn)座子編碼的TnpB核酸酶。然而，連接轉(zhuǎn)座子活性和CRISPR免疫的分子機制一直不清楚。

為了探究V型CRISPR-Cas系統(tǒng)的起源，研究人員開發(fā)了一種統(tǒng)一的挖掘策略，該策略結(jié)合了TnpB和Cas12核酸酶之間共享的催化基序、結(jié)構(gòu)域和序列相似性。

通過搜索原核生物基因組和宏基因組數(shù)據(jù)庫，他們鑒定出146個TnpB樣CRISPR相關(guān)蛋白。通過系統(tǒng)發(fā)育分析、基于AlphaFold的結(jié)構(gòu)預(yù)測以及功能元件比較，研究人員最終確定了六個中間分支，統(tǒng)稱為TranCs，它們構(gòu)成了特定TnpB譜系的姊妹群。值得注意的是，分支3、11、12、13和14起源于IS605，而先前報道的分支8起源于IS607，它們代表了TnpB和Cas12之間的關(guān)鍵進化中間體。

功能分析揭示了TranCs獨特的雙向?qū)NA機制。研究人員發(fā)現(xiàn)，五個TranC系統(tǒng)不僅利用其固有的CRISPR RNA進行DNA靶向，還保留了利用轉(zhuǎn)座子衍生的reRNA來指導(dǎo)DNA切割的祖先能力。這種雙重指導(dǎo)能力提供了一個功能性標志，表明TranCs是進化中的中間體。

對LaTranC-sgRNA-DNA復(fù)合物的冷凍電鏡分析也揭示了其與ISDra2 TnpB-reRNA-DNA復(fù)合物驚人的相似性，但有一個關(guān)鍵區(qū)別：單一的reRNA發(fā)生了功能分裂，形成了兩個組成部分，即tracrRNA和crRNA。對reRNA和CRISPR RNA的協(xié)方差分析以及AlphaFold蛋白質(zhì)模型比較將這一觀察結(jié)果擴展到了來自IS605和IS607的三個分支，確立了RNA分裂是Cas12出現(xiàn)的一個共同標志。

重要的是，工程實驗證實，人為地分裂TnpB的reRNA足以將TnpB轉(zhuǎn)化為一個能夠使用CRISPR陣列作為向?qū)NA來源的類CRISPR系統(tǒng)。這些結(jié)果表明，RNA層面的創(chuàng)新，而非主要的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化，是驅(qū)動V型CRISPR-Cas系統(tǒng)起源的主要分子事件。

這項研究不僅闡明了V型CRISPR系統(tǒng)進化背后的分子機制，而且鑒定出了一組具有靈活向?qū)NA的緊湊型核酸酶，為開發(fā)更小、更通用且更易于控制的CRISPR工具提供了設(shè)計原則。