深圳子科生物報道：著名遺傳學George Church是哈佛醫(yī)學院的遺傳學教授、Wyss研究所的核心成員。他開發(fā)了首個直接基因組測序和DNA多重化方法，為1994年破譯首個細菌基因組合2003年的二代測序技術奠定基礎。在CRISPR/Cas出現(xiàn)在大眾視野之前，Church就已經(jīng)撰文詳細介紹了Cas9 靶定方法、改造進展，并就未來臨床上的潛在應用提出建議。

Church表示：“我是一個技術狂，年輕時，我會采取不限于生物學的各種技術手段，也使得我看到了許多罕見的食物。我曾預測到將來可能會在人體細胞中編輯基因，于是一旦將實驗室組建起來，就立馬投入這項工作，并且發(fā)現(xiàn)在人體細胞中編輯DNA很有效?！?

在最新的一項研究中，Church研究組發(fā)表了一項新技術，可以利用不斷發(fā)展的遺傳條形碼來記錄發(fā)育中小鼠細胞分裂的過程，追溯小鼠體內(nèi)每個細胞的譜系單細胞來源。 這種方法能幫助科學家確定不同細胞出現(xiàn)的位置和時間，以及不同細胞類型之間的密切關系，從而前所未有地深入探索從受精卵到成年人的這個奇妙生命旅程。

這一研究成果公布在Science雜志上。

生命奇妙旅程

隨著生物機體的發(fā)育，每個細胞都從其親本細胞中繼承了hgRNA序列突變，并獲得其自身獨特的突變，然后將其傳遞給后代細胞。通過比較身體不同部位（肺，肝和神經(jīng)元）的細胞之間的突變模式，科學家可以確定這些部位何時發(fā)展，以及它們彼此之間的密切關系。

人體開始于單個細胞，細胞重復分裂形成兩個，然后是四個，然后是八個，一直到構成新生兒的約260億個細胞。追蹤這些260億個細胞是如何以及何時從一個受精卵中產(chǎn)生的，是發(fā)育生物學的一大挑戰(zhàn)，這個領域到目前為止只能捕獲和分析部分快照圖像。

CRISPR條形碼

“當前的譜系跟蹤方法只能及時顯示快照圖像，要想看清楚每一步，必須在物理上停止發(fā)育過程，就像看電影的各個幀一樣”，Church說。

遺傳條形碼是使用特殊類型的DNA序列創(chuàng)建的，該序列編碼一種稱為歸巢指導RNA（hgRNA）的修飾RNA分子，設計hgRNA分子使得當存在Cas9（CRISPR-Cas9）時，hgRNA將引導Cas9至其基因組中的自身hgRNA序列，然后Cas9進行切割。細胞修復切割時，它可以在hgRNA序列中引入基因突變，其隨著時間累積以產(chǎn)生獨特的條形碼。

“這種條形碼記錄方法使我們能夠重建每個成熟細胞發(fā)育的完整歷史，就像實時向后播放完整的動態(tài)圖像一樣?！?

這種方法令細胞譜系追蹤成為了可能，通過不斷發(fā)展的遺傳條形碼，記錄發(fā)育中小鼠的細胞分裂過程，追蹤實現(xiàn)每一種譜系。小鼠體內(nèi)的細胞可以追溯到它的單細胞來源。

研究人員通過創(chuàng)建一種“原始小鼠（founder mouse）”在小鼠體內(nèi)構建hgRNA-Cas9系統(tǒng)，該小鼠在其基因組中有60種不同的hgRNA序列。然后，研究人員讓表達Cas9蛋白的小鼠與原始小鼠雜交，產(chǎn)生受精卵，受精后hgRNA序列開始切割和突變。

“在受精卵分裂的每一個細胞中，它的hgRNA都有可能發(fā)生變異，”第一作者，Wyss Institute和HMS的博士后研究員Reza Kalhor博士解釋道，“在每一代中，除了從母細胞中遺傳的細胞外，所有細胞都獲得了自己獨特的突變，因此我們可以通過比較它們具有的突變來追蹤相關的不同細胞。”

每個hgRNA可以產(chǎn)生數(shù)百個突變等位基因?？偟膩碚f，它們可以生成一個獨特的條形碼，包含成年小鼠中約100億個細胞中每個細胞的完整發(fā)育譜系。

解答關鍵問題

通過連續(xù)記錄細胞發(fā)育過程，研究人員也可以解決關于胚胎大腦的長期問題——首先大腦是將其前端與后端區(qū)分開來，還是先將其左側(cè)與右側(cè)區(qū)分開來？

研究人員通過比較兩只小鼠腦部不同部位的細胞中存在的hgRNA突變條形碼，發(fā)現(xiàn)每個腦區(qū)左側(cè)的神經(jīng)元與同一區(qū)域右側(cè)的神經(jīng)元關系更密切，這說明，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的左右patterning之前出現(xiàn)了前后腦patterning。

“這種方法使我們能夠進入模型生物體的最終發(fā)育階段，并從那里重建一個完整的譜系樹，一直追溯到它的單細胞階段。這是一個有野心的目標，肯定需要許多實驗室?guī)啄瓴拍軐崿F(xiàn)，但本文代表了實現(xiàn)目標的重要一步，”Church說。研究人員現(xiàn)在專注于改進他們的讀出技術，希望可以分析單個細胞的條形碼并重建已記錄的譜系樹。

“隨著時間的推移，能夠連續(xù)記錄細胞歷史將成為是發(fā)育生物學中的一個重要里程碑，它有望以指數(shù)方式增加我們對單細胞生長形成成年動物的過程的理解，如果應用于疾病模型，它可以提供關于疾病如癌癥如何出現(xiàn)的新見解，”Wyss研究所創(chuàng)始主任Donald Ingber說。

其它條形碼研究進展

Aaron McKenna和同事們開發(fā)出了一種叫做GESTALT的譜系追蹤方法。這種方法將獨特的突變模式引入到了稱作為基因組條形碼的短遺傳序列中。隨后利用子細胞中突變條形碼的DNA序列來重建細胞譜系關系。

McKenna等在細胞培養(yǎng)物和活體斑馬魚中證實了這一技術的效力。在斑馬魚的胚胎階段引入條形碼，并在成年期分析各種組織，研究人員發(fā)現(xiàn)少數(shù)的幾個胚胎祖細胞生成了構成成體器官的大多數(shù)細胞。例如在4月齡的斑馬魚中觀察到1,138個基因變異體中只有5個生成了98%以上的血細胞。

作者們指出，在未來的分析中可以利用這一新技術來追蹤正常發(fā)育中更加復雜的多細胞過程，還可以利用它來鑒別出腫瘤和轉(zhuǎn)移灶的細胞起源。