深圳子科生物報道：基因編輯工具的快速發(fā)展令生物學研究領域著迷，目前第三代DNA剪刀的主角是CRISPR，而2016年新出現的一種新堿基編輯方法：不會引起隨機的DNA缺失和插入，而是替換一個DNA基因，也吸引了生物學家的注意。

這種稱為單堿基編輯的方法是由與CRISPR-Cas9（nCas9，切口酶）變體與另外一種稱為胞嘧啶脫氨酶（cytosine deaminase）構成，用T代替C，通過導向RNA直接指向正確DNA位置。

單堿基編輯器主要分為兩類，胞嘧啶單堿基編輯器(CBE)與腺嘌呤單堿基編輯器(ABE)，分別由胞嘧啶脫氨酶或改造的腺嘌呤脫氨酶與nCas9蛋白融合而來，對應地可在基因組中的靶向位點實現C>T或A>G的堿基編輯。目前，CBE與ABE已在多個物種中得到了廣泛應用。

然而，對它們脫靶效應的檢測還很不充分，數據主要來源于體外實驗研究或者對利用生物信息學軟件預測的有限的靶序列相似位點的檢測，CBE與ABE在體內全基因組范圍的脫靶效應還未得到評估。

來自中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所高彩霞研究組首次在體內利用全基因組測序技術全面分析和比較了三種單堿基編輯系統在基因組水平上的脫靶效應。

他們在植物中對BE3(基于融合rAPOBEC1胞嘧啶脫氨酶的CBE系統)，HF1-BE3（高保真版本BE3）與ABE單堿基編輯系統的特異性進行了全基因組水平評估，首次在體內利用全基因組測序技術全面分析和比較了這三種單堿基編輯系統在基因組水平上的脫靶效應。

這項研究對經過不同單堿基編輯系統轉化的56棵T0代水稻植株與21株對照植株進行全基因組測序。進一步序列統計分析發(fā)現，經過單堿基編輯系統處理后，基因組內的插入或刪除（indels）突變的數量與對照組相比沒有顯著變化，但是BE3與HF1-BE3，無論是在有無sgRNA的情況下，均可在水稻基因組中造成大量的單核苷酸變異(SNVs)，且大部分為C>T類型的堿基突變。與經過農桿菌轉化但不含任何堿基編輯系統的對照植株相比，BE3系統和HF1-BE3系統處理的植株在基因組范圍內的C>T SNVs分別增加了94.5%和231.9%，大約額外產生了98個C>T SNVs和242個C>T SNVs。

這項研究表明現有BE3和HF1-BE3系統，而非ABE系統，可在植物體內造成難以預測的脫靶突變，因此，需要進一步優(yōu)化提高其特異性。該工作創(chuàng)新性地利用相似遺傳背景的克隆植物及全基因組重測序解決了以前大量異質細胞序列分析的復雜性。

此外，中國科學院神經科學研究所、上海腦科學與類腦研究中心與計算生物學研究所等處合作，建立了一種被命名為GOTI（Genome-wide Off-target analysis by Two-cell embryo Injection）的新型脫靶檢測技術，為基因編輯工具的安全性評估帶來了突破性的新工具，有望成為新的行業(yè)檢測標準。

這項研究與上述研究均發(fā)表在3月1日的Science雜志上，本文通訊作者為中科院神經所楊輝研究員, 計算生物學所李亦學研究員，斯坦福大學Lars M. Steinmetz教授。

要提升檢測脫靶效應的精度，就必須徹底顛覆原有的脫靶檢測手段。首先，為了實現不借助于脫靶位點預測，這就要求必須找到非常嚴格的對照組來確定基因突變的位點；同時為了檢測不依賴于sgRNA的隨機突變，最好使用基于單細胞全基因組測序。

為了實現以上目標，楊輝研究組與合作者建立了一種名叫“GOTI”的脫靶檢測技術。研究者們在小鼠受精卵分裂到二細胞期的時候，編輯一個卵裂球，并使用紅色熒光蛋白將其標記。小鼠胚胎發(fā)育到14.5天時，將整個小鼠胚胎消化成為單細胞，利用流式細胞分選技術基于紅色熒光蛋白，分選出基因編輯細胞和沒有基因編輯細胞，再進行全基因組測序比較兩組差異。這樣就避免了單細胞體外擴增帶來的噪音問題。而且由于實驗組和對照組來自同一枚受精卵，理論上基因背景完全一致，因此直接比對兩組細胞的基因組，其中的差異基本就可以認為是基因編輯工具造成的。

在楊輝實驗室全體成員與合作單位的共同努力下，GOTI系統被成功建立了起來。借助于這個系統，團隊成員先是檢測了最經典的CRISPR/Cas9系統。

結果發(fā)現，設計良好的CRISPR/Cas9并沒有明顯的脫靶效應，這個結果結束了之前對于CRISPR/Cas9脫靶率的爭議。然而團隊還檢測了另一個同樣被給予厚望的CRISPR/Cas9衍生技術BE3，這個系統可以精確引入點突變，在之前的研究中從未發(fā)現過有明顯的脫靶問題。

然而在GOTI的檢測下發(fā)現，BE3存在非常嚴重的脫靶，而且這些脫靶大多出現在傳統脫靶預測認為不太可能出現脫靶的位點，因此之前方法一直沒有發(fā)現其脫靶問題。團隊分析后認為，這些脫靶位點有部分出現在抑癌基因上，因此經典版本的BE3有著很大的隱患，目前不適合作為臨床技術。研究團隊的這些重要發(fā)現，證實了以BE3為代表的部分基因編輯技術存在無法預測的脫靶風險，讓世人重新審視了這些新興技術的風險。

更重要的是，此工作建立了一種在精度、廣度和準確性上遠超越之前的基因編輯脫靶檢測技術，有望由此開發(fā)精度更高、安全性更大的新一代基因編輯工具，建立行業(yè)的新標準。

原文標題：

Cytosine base editor generates substantial off-target single-nucleotide variants in mouse embryos

Cytosine, But not Adenine, Base Editors Induce Genome-wide Off-target Mutations in Rice