子科生物報(bào)道：膽道閉鎖（biliary atresia, BA）在新生兒期發(fā)病，是免疫介導(dǎo)的肝外和/或肝內(nèi)膽管阻塞，導(dǎo)致病理性黃疸以及肝硬化和肝衰竭等嚴(yán)重危及嬰幼兒生命的疾病。BA在我國(guó)兒童中的發(fā)病率約為1/8,000，與兒童期各種腫瘤發(fā)病率之和相當(dāng)。BA確診后需立即行肝門腸吻合術(shù)（葛西手術(shù)）以疏通膽汁流。多數(shù)未行葛西術(shù)手術(shù)的患兒在一年內(nèi)就會(huì)發(fā)展成終末期肝硬化和肝功能衰竭。葛西術(shù)后超過(guò)一半的患兒也需進(jìn)行肝移植手術(shù)以挽救生命，很多自肝生存患兒長(zhǎng)期受累于反復(fù)膽管炎癥、門靜脈高壓、食管靜脈曲張性出血、肝性骨營(yíng)養(yǎng)不良等癥狀。雖然動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床觀察提示圍產(chǎn)期/新生兒病毒感染引發(fā)的自身免疫性肝損傷是BA發(fā)病的重要機(jī)制，但導(dǎo)致肝硬化和肝衰竭的免疫病理機(jī)制以及靶向干預(yù)方案仍待闡述。

2020年11月27日，北京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)前沿創(chuàng)新中心（BIOPIC）、北京未來(lái)基因診斷高精尖創(chuàng)新中心（ICG）、生命科學(xué)學(xué)院的白凡研究員團(tuán)隊(duì)與廣州醫(yī)科大學(xué)附屬?gòu)V州市婦女兒童醫(yī)療中心兒科研究所的張玉霞教授團(tuán)隊(duì)、該中心外科實(shí)驗(yàn)室的溫哲教授、夏慧敏教授團(tuán)隊(duì)合作在Cell雜志以研究長(zhǎng)文的形式發(fā)表題為 Liver immune profiling reveals pathogenesis and therapeutics for biliary atresia 的研究論文。該工作以臨床隊(duì)列為研究對(duì)象、借助單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)、動(dòng)物及臨床試驗(yàn)，系統(tǒng)描繪了BA患兒肝臟免疫圖譜，提出B細(xì)胞耐受缺陷、殺傷性T細(xì)胞擴(kuò)增、巨噬細(xì)胞低炎反應(yīng)性、Kupffer細(xì)胞清道夫功能障礙、組織修復(fù)性CX3CR1+T/NK細(xì)胞的缺乏共同促進(jìn)了BA患兒的肝硬化和肝衰竭進(jìn)展。尤其值得強(qiáng)調(diào)的是，團(tuán)隊(duì)首次報(bào)道新生兒肝臟存在完整的B細(xì)胞造血功能，（病毒感染后）因B細(xì)胞耐受缺陷產(chǎn)生了大量的自身反應(yīng)性IgG抗體。在一項(xiàng)探索性臨床試驗(yàn)中，用利妥昔單抗（Rituximab）對(duì)4例BA患兒的B細(xì)胞進(jìn)行了清除性治療，發(fā)現(xiàn)利妥昔單抗治療后BA患兒肝臟紊亂的免疫系統(tǒng)恢復(fù)到了健康狀態(tài)。

隊(duì)列特征與肝臟免疫圖譜
團(tuán)隊(duì)對(duì)一萬(wàn)多份臨床病例（健康對(duì)照2471份、生理性黃疸9297份、膽總管囊腫248份、膽道閉鎖（BA）927份）進(jìn)行了回顧性分析，證實(shí)BA患兒存在持續(xù)性肝損傷。為闡述免疫病理機(jī)制，該研究對(duì)6例BA患兒的肝活檢組織，以及10例對(duì)照肝組織進(jìn)行了單細(xì)胞測(cè)序，并對(duì)T細(xì)胞和B細(xì)胞進(jìn)行了V（D）J測(cè)序，最終定義了42個(gè)免疫細(xì)胞亞群，發(fā)現(xiàn)與肝硬化和肝衰竭相關(guān)的如下免疫功能失調(diào)：

BA嬰兒肝臟中細(xì)胞毒細(xì)胞擴(kuò)增，Th17-Th1轉(zhuǎn)分化加強(qiáng)

研究發(fā)現(xiàn)具有細(xì)胞毒性的cTh1和兼具Th17和Th1特征 ex-cTh17在BA患兒肝臟中顯著增加，TCR分析發(fā)現(xiàn)BA患者肝臟內(nèi)ex-cTh17和 cTh1之間的轉(zhuǎn)分化加劇。ex-cTh17和cTh1都具有高細(xì)胞毒性、 促纖維化以及高趨化性等特征。除CD4 T細(xì)胞外，γδ T17和MAIT17也表現(xiàn)出Th1特征（TBX21+ STAT4+ EOMES+ IFN-γhi），這說(shuō)明BA患兒肝臟微環(huán)境的改變會(huì)促進(jìn)Th17向Th1的轉(zhuǎn)分化。BA患者肝臟內(nèi)高細(xì)胞毒性的CD8Trm比例及克隆擴(kuò)增顯著增加， CX3CR1+CD8Teff到CD8Trm的轉(zhuǎn)分化顯著增多，具有免疫保護(hù)以及抑制成纖維作用的CX3CR1+ CD8Teff細(xì)胞比例及其CX3CR1表達(dá)量顯著降低。

B細(xì)胞淋巴細(xì)胞生成和耐受缺陷促進(jìn)自身反應(yīng)性B細(xì)胞的擴(kuò)增

一直以來(lái)都認(rèn)為肝臟中的血細(xì)胞生成發(fā)生在人類胎肝中，出生后已經(jīng)停止。出乎意料的是研究者發(fā)現(xiàn)B細(xì)胞淋巴細(xì)胞生成過(guò)程在出生后的嬰兒肝臟中仍完好無(wú)損 （造血干細(xì)胞、pre-pro-B、pro-B、pre-B、immature B、Transitional B、na?ve B、memory B （CD27- 和 CD27+）、漿母細(xì)胞和漿細(xì)胞（圖2A-B）。運(yùn)用Bulk RNAseq的方法發(fā)現(xiàn)在肝臟和骨髓中，對(duì)應(yīng)的B細(xì)胞在其各自的發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄譜幾乎相同。流式和免疫熒光染色也顯示B細(xì)胞前體細(xì)胞（RAG1/2+CD10+）在肝臟的存在（圖2C-D）。此外，盡管發(fā)育中的CD10+ B細(xì)胞的比率隨著年齡增長(zhǎng)而下降，但至少在出生后的4個(gè)月內(nèi)仍持續(xù)著B細(xì)胞生成。對(duì)人類骨髓B細(xì)胞的研究表明，大多數(shù)前體細(xì)胞和未成熟B細(xì)胞具有自身反應(yīng)性B細(xì)胞受體（BCR）。這些B細(xì)胞出骨髓到外周系統(tǒng)需要清除高自身親和力的BCR，這一過(guò)程被稱為中樞耐受【1】。研究者認(rèn)為肝臟B細(xì)胞的耐受性缺失可能是導(dǎo)致BA肝臟損傷的重要原因。通過(guò)一系列分析，發(fā)現(xiàn)BA患兒的記憶 B細(xì)胞、漿母細(xì)胞和漿細(xì)胞的BCR具有自身反應(yīng)性的特征，并且它們的Ig 類型轉(zhuǎn)換也明顯受到抑制。通過(guò)免疫球蛋白濃度的測(cè)量證實(shí)BA患者肝臟具有保護(hù)性質(zhì)的 IgM特異性自身抗體濃度降低，而具有損傷作用的IgG特異性自身抗體濃度升高，并且患者無(wú)黃疸的存活時(shí)間與IgM/IgG4比值有正相關(guān)關(guān)系。

膽汁酸淤積抑制肝臟巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)和Kupffer細(xì)胞吞噬功能

研究者通過(guò)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組以及實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)比較肝活檢樣本勻漿中細(xì)胞因子的濃度，發(fā)現(xiàn)BA患者肝內(nèi)髓系細(xì)胞的炎癥反應(yīng)和趨化作用被明顯抑制（圖3D 和F），此外，BA患者Kupffer的清道夫功能顯著受損 。已有的報(bào)道顯示膽汁酸通過(guò)細(xì)胞表面受體TGR5（由GPBAR1編碼）以環(huán)狀A(yù)MP（cAMP）-蛋白激酶A（PKA）依賴性方式抑制巨噬細(xì)胞的炎癥、趨化性和吞噬功能，因此研究者探討了膽汁酸在BA患兒肝臟髓系細(xì)胞功能障礙產(chǎn)生中的貢獻(xiàn) 。通過(guò)表達(dá)相關(guān)性分析，研究者證實(shí)GPBAR1表達(dá)與cAMP信號(hào)傳導(dǎo)正相關(guān)，這導(dǎo)致炎癥基因的表達(dá)抑制 。因此，BA肝臟髓系細(xì)胞的低炎癥狀態(tài)可能是由膽汁酸在肝臟的積累導(dǎo)致的。

CX3CL1-CX3CR1纖維化控制機(jī)制失調(diào)

肝星狀細(xì)胞分泌趨化因子CX3CL1介導(dǎo)CX3CR1+淋巴細(xì)胞、Kupffer以及單核巨噬細(xì)胞的募集和粘附。Cx3cr1缺失的小鼠分泌大量的TNF-α和TGF-β，從而激活肝星狀細(xì)胞并促進(jìn)纖維化。共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了CX3CR1+ CD8Teff細(xì)胞可抑制肝星狀細(xì)胞系（LX-2細(xì)胞）促纖維化基因的表達(dá)。因此BA患者肝內(nèi)CX3CR1+ CD8Teff的缺乏可促進(jìn)肝纖維化的進(jìn)程。

CX3CR1+循環(huán)NK細(xì)胞（cir-NK）和循環(huán)NKT細(xì)胞（cir-NKT）在BA患兒肝臟內(nèi)的比率也顯著降低。CX3CR1+ T和NK細(xì)胞都高表達(dá)編碼促進(jìn)細(xì)胞遷移以及與非淋巴細(xì)胞相互作用的基因；轉(zhuǎn)錄因子分析揭示CX3CR1+ T和NK細(xì)胞內(nèi)兼具有高ASCL2和KLF2的轉(zhuǎn)錄活性，且它們的靶基因富集在參與細(xì)胞遷移和膠原結(jié)合的通路上。實(shí)驗(yàn)證實(shí)ASCL2可結(jié)合在KLF2的啟動(dòng)子，而KLF2可結(jié)合在CX3CR1的啟動(dòng)子(圖4F)，提示ASCL2-KLF2-CX3CR1軸調(diào)控CX3CR1+T和NK細(xì)胞CX3CR1的表達(dá)和功能。此外，BA患者肝臟內(nèi)CX3CL1的濃度顯著降低 。這些發(fā)現(xiàn)都提示在BA肝臟中具有抑制肝臟纖維化作用的CX3CR1+CD8Teff和NK細(xì)胞減少可能與細(xì)胞本身趨化能力降低以及肝臟趨化因子減少有關(guān)。在小鼠模型中也證實(shí)了這一發(fā)現(xiàn)。關(guān)于肝臟中CX3CR1+T和NK細(xì)胞如何參與肝臟纖維化的調(diào)節(jié)，本研究也進(jìn)行了初步的探討，認(rèn)為Granzyme B參與介導(dǎo)了CX3CR1+T和NK細(xì)胞對(duì)成纖維細(xì)胞的殺傷 。

B細(xì)胞修飾療法治療BA的初步探討

除了產(chǎn)生自身抗體外，B細(xì)胞還可以通過(guò)MHC介導(dǎo)的抗原呈遞或可溶性介質(zhì)來(lái)修飾T，NK和髓系細(xì)胞的功能，據(jù)此推測(cè)B細(xì)胞修飾療法可以緩解BA的肝損傷。通過(guò)RRV誘導(dǎo)的BA疾病鼠模型研究發(fā)現(xiàn)與未治療的RRV小鼠相比，anti-CD20抗體組（清除成熟B細(xì)胞），或anti-MHC I和II組（阻斷MHC-I或II介導(dǎo)的抗原呈遞），可顯著增加體重并減少黃疸發(fā)生。除此之外，B細(xì)胞修飾療法組的BA鼠肝內(nèi)Cx3cl1和C1q的濃度顯著升高、Kuppfer細(xì)胞的數(shù)目及其清道夫功能得到恢復(fù)、肝臟內(nèi)的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)降低、肝纖維化程度得到緩解。鑒于BA小鼠模型中顯示的功效，研究者進(jìn)一步探索了抗CD20治療對(duì)BA患兒的治療作用。

研究團(tuán)隊(duì)在試驗(yàn)性臨床研究中招募了4名BA患兒進(jìn)行治療。發(fā)現(xiàn)單劑RTX（利妥昔單抗，anti-CD20）是安全的。在使用RTX一天后，外周血和肝來(lái)源的成熟B細(xì)胞被有效清除，在使用RTX 2-3個(gè)月后，B細(xì)胞恢復(fù)正常水平。與未經(jīng)RTX治療的14名BA患者相比，RTX治療后4名試驗(yàn)受試者中自身抗體濃度降低 。研究者對(duì)3位接受RTX治療的BA患者的肝活檢樣本進(jìn)行了scRNA-seq測(cè)序，發(fā)現(xiàn)CD20+ B細(xì)胞被清除，而不表達(dá)CD20的B細(xì)胞前體細(xì)胞RAG1/2 + B細(xì)胞和成熟的漿細(xì)胞PC并未受到明顯影響 。此外，RTX的使用降低了BA肝臟中CD8Trm細(xì)胞的比例和克隆擴(kuò)增， CX3CR1+ CD8Teff和CD8Trm之間的轉(zhuǎn)分化也明顯減少 。轉(zhuǎn)錄組比較分析發(fā)現(xiàn)使用RTX的患者CX3CR1+ CD8Teff細(xì)胞中CX3CR1和GZMA/B表達(dá)增強(qiáng)、CD8Trm細(xì)胞中的IFNG表達(dá)降低、單核巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)性和清道夫功能以及cTh17細(xì)胞中Th17特征基因的表達(dá)增高?？偟膩?lái)說(shuō)，短暫的B細(xì)胞清除可能可以作為恢復(fù)BA嬰兒肝免疫穩(wěn)態(tài)的術(shù)前或術(shù)后策略 。

這項(xiàng)研究不僅提供了較為全面的導(dǎo)致BA患兒肝臟快速衰竭的免疫致病機(jī)制，同時(shí)提出B細(xì)胞修飾療法可以改善BA患兒的肝臟病理。北京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)前沿創(chuàng)新中心（BIOPIC）、北京未來(lái)基因診斷高精尖創(chuàng)新中心（ICG）、生命科學(xué)學(xué)院白凡研究員，廣州市婦女兒童醫(yī)療中心的張玉霞教授、溫哲教授、夏慧敏教授是本文的共同通訊作者。廣州市婦女兒童醫(yī)療中心的王俊副研究員、徐艷慧博士、北京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)前沿創(chuàng)新中心的陳章華博士生、廣州市婦女兒童醫(yī)療中心外科的梁鑒坤博士、林澤峰博士以及梁會(huì)營(yíng)主任是本文的共同第一作者。