?細(xì)胞核-胞漿蛋白-胞膜制備試劑盒

貨號(hào)：ZK-PL3516

規(guī)格：50次100次

描述：本試劑盒能夠從哺乳動(dòng)物新鮮或凍存的組織塊、貼壁或懸浮細(xì)胞中制備細(xì)胞核、細(xì)胞膜與胞內(nèi)質(zhì)膜、細(xì)胞漿等三種主要亞細(xì)胞組分。其獨(dú)特的試劑成分與優(yōu)化的制備方案使胞核-胞漿-胞膜制備過(guò)程簡(jiǎn)單易行，無(wú)需特殊設(shè)備和超速離心，可在1小時(shí)內(nèi)完成。應(yīng)用本試劑盒制備的胞膜是細(xì)胞膜和細(xì)胞器膜如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及質(zhì)膜的混合物，得到的細(xì)胞核是完整的未裂解細(xì)胞核，胞漿組分為可溶性胞漿蛋白。制備得到的產(chǎn)物純度可勝任后續(xù)的免疫沉淀、蛋白印跡、2-D gel、酶活性檢測(cè)和受體分析等實(shí)驗(yàn)。

組成:（以下是50次規(guī)格用量）

CER (Cytosol Extraction Reagent)     25ml

MER (Membran Extraction Reagent)     2.5ml

             NER (NuclearExtractionReagent)       50ml Suspension Buffer 10m

儲(chǔ)存：各組分4℃有效期12個(gè)月

規(guī)格：50次  100次

操作步驟：

一.樣本預(yù)處理：

收集細(xì)胞：（在每一次制備過(guò)程中，使用等量的細(xì)胞數(shù)將明顯提高后續(xù)檢測(cè)結(jié)果的一致性，因此建議在制備前對(duì)細(xì)胞準(zhǔn)確計(jì)數(shù)）

1. 貼壁細(xì)胞：用PBS緩沖液沖洗細(xì)胞平皿，用胰蛋白酶消化細(xì)胞。800g離心5-10分鐘，棄上清，用PBS緩沖液重懸洗滌細(xì)胞并再次離心收集細(xì)胞。

2. 懸浮細(xì)胞：800g離心5-10分鐘，棄上清。用PBS緩沖液重懸洗滌細(xì)胞并再次離心收集細(xì)胞。

以下制備過(guò)程要在4oC或冰水浴中進(jìn)行

二.組織細(xì)胞勻漿裂解

1.細(xì)胞勻漿裂解：

向每1x107個(gè)細(xì)胞或每100μl（細(xì)胞離心后的體積）細(xì)胞沉淀中加入500μlCER試劑，震蕩重懸，冰浴2分鐘。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到冰預(yù)冷的玻璃勻漿器內(nèi)，在冰水浴中上下手動(dòng)勻漿20-30次。

注意：此破碎細(xì)胞步驟為關(guān)鍵環(huán)節(jié)。要使用1-3ml小容積玻璃勻漿器，須選用間隙嚴(yán)密的研杵，其特征是將研杵插入勻漿器套管后，可提起研杵而套管不會(huì)脫落。有效研磨是上下推拉而不是旋轉(zhuǎn)。破碎效果與細(xì)胞類(lèi)型有關(guān)，可在相差顯微鏡下檢查，未裂解細(xì)胞應(yīng)小于5%。

2.組織塊勻漿裂解：

取250mg哺乳動(dòng)物新鮮或-80oC凍存組織塊放入冰預(yù)冷的玻璃勻漿器內(nèi)，加入500μlCER試劑。用研杵搗碎組織塊，上下手動(dòng)勻漿20次，冰浴10分鐘，然后上下手動(dòng)勻漿7次。

注意：與培養(yǎng)細(xì)胞特別是貼壁細(xì)胞相比，組織塊中的細(xì)胞在勻漿時(shí)較易破碎，因而并非必須選擇間隙嚴(yán)密的研杵。如果研杵與套管過(guò)于嚴(yán)密，會(huì)使組織勻漿困難，可選用研杵與套管稍松的勻漿器，破碎效果與組織細(xì)胞類(lèi)型有關(guān)，可在相差顯微鏡下檢查，未裂解細(xì)胞應(yīng)少于5%。

三.粗提物制備：

取約500μl裂解物，轉(zhuǎn)移到新的離心管中，800g ,4oC離心5分鐘。此時(shí)，細(xì)胞核的粗制品沉淀在管底，上清為胞膜-胞漿混合物。

四.胞膜胞漿制備：

1）將步驟三獲得的上清轉(zhuǎn)移到新的離心管中，估計(jì)上清的體積；

2）加入上清液1/10體積的MER與上清液混合，冰浴5分鐘；

3）14,000rpm，4oC離心30分鐘；

4）取上清液轉(zhuǎn)移到新離心管中，此為胞漿組分；

5）沉淀為胞膜組分，含有細(xì)胞膜和亞細(xì)胞器碎片，可短暫離心除盡液體，用50-100μl Suspension Buffer 或自備溶液重懸胞膜。

五.細(xì)胞核制備：

1）向步驟三中獲得的細(xì)胞核粗提物中加入500μl NER，震蕩重懸；

2）4,000g,4oC離心5分鐘，棄上清；

3）再次加入500μl NER洗滌細(xì)胞核沉淀，重復(fù)上述離心步驟，離心后的上清應(yīng)為清亮； 

4）棄上清，除盡液體。用50-100μlSuspension Buffer重懸細(xì)胞核，得到完整和沒(méi)有破碎的細(xì)胞核。用戶(hù)也可以使用自備溶液如SDS上樣緩沖液直接裂解細(xì)胞核。

說(shuō)明：

1.Suspension Buffer 不含去垢劑，重懸于Suspension Buffer 中的胞膜或胞核組分呈不溶解狀態(tài)是正常的，用戶(hù)可用自備溶液重懸胞膜或胞核成分。如果進(jìn)行蛋白印跡、2-Dget等實(shí)驗(yàn)，用戶(hù)可用SDS上樣緩沖直接裂解細(xì)胞膜或細(xì)胞核成分。對(duì)于進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)來(lái)說(shuō)，可用RIPA裂解液重懸胞膜或胞核組分。

2.胞漿組分可直接進(jìn)行蛋白定量。純的胞膜和胞核蛋白濃度很低，但與胞漿蛋白濃度成比例，因而不需要單獨(dú)定量，如需定量可加入TritonX-100至終濃度1%或SDS至終濃度0.5%用BCA法蛋白定量。

3.用SDS-PAGE Loading 緩沖液裂解細(xì)胞核后，DNA釋放會(huì)使核裂解物十分粘稠，可95oC加熱5分鐘，高速震蕩打斷DNA，重復(fù)加熱2-3次。

4.如果進(jìn)行凝膠阻滯（EMSA）實(shí)驗(yàn)，建議使用普利萊P1200產(chǎn)品，該試劑盒可直接提取可溶性核蛋白.

5.試劑盒各組分中未添加蛋白酶抑制劑，用戶(hù)可自行選擇添加，通常4oC快速操作不加蛋白酶抑制劑不會(huì)出現(xiàn)問(wèn)題。

6.沉淀胞漿蛋白方法：估算胞漿蛋白組分的體積，加入1/3體積30%三氯醋酸水溶液，-20oC沉淀1小時(shí)或過(guò)夜。5,000g,4oC離心10分鐘，棄上清，空氣略干沉淀。用1xSDS上樣緩沖液溶解沉淀，95oC加熱5分鐘，上樣電泳。