?組織細(xì)胞總蛋白抽提試劑盒

貨號(hào)：ZK-PL3503?

描述：從組織細(xì)胞中提取總蛋白是Western Blot的關(guān)鍵步驟。實(shí)體軟組織如腦脊髓富含磷脂，神經(jīng)血管含大量結(jié)締組織，而脂肪則含有大量油脂，常規(guī)的方法難以有效從這些組織中提取蛋白。本試劑盒為組織或培養(yǎng)細(xì)胞總蛋白提取提供完整的解決方案。用裂解-結(jié)合緩沖液勻漿裂解實(shí)體組織，或直接用裂解-結(jié)合緩沖液重懸培養(yǎng)細(xì)胞，然后加入抽提試劑去除非蛋白成分，離心、干燥后即可得到總蛋白。蛋白沉淀溶解后用常規(guī)方法進(jìn)行蛋白定量。提取過(guò)程可在30-60分鐘內(nèi)完成，可在1.5mL離心管微量提取也可大規(guī)模制備，極為簡(jiǎn)便高效。

規(guī)格：

50次 100次

儲(chǔ)存：

室溫或4oC 24個(gè)月有效

操作步驟：

固體組織蛋白提取

1. 每10-100mg固體組織剪碎后加入0.5-1mL裂解液，放入玻璃勻漿器內(nèi)上下手動(dòng)勻漿15次；或用高速機(jī)械勻漿器12,000rpm破碎組織。少量小的未破碎組織不影響后續(xù)抽提。注意：肝腎脾組織蛋白含量高，提取時(shí)應(yīng)加較少量的組織，一般不超過(guò)50mg,否則形成的蛋白膜厚、致密且難溶。

2. 僅取0.5mL組織勻漿液轉(zhuǎn)移到1.5mL離心管，棄去剩余的組織勻漿液。每0.5mL組織勻漿液加入2倍體積的(1mL)抽提試劑充分混勻。室溫或4oC 靜置10分鐘,偶爾晃動(dòng)。注意：(1)如組織量<10mg,在下一步離心時(shí)形成的蛋白膜易碎，靜置30min有助蛋白膜形成。(2)提取脂肪組織時(shí)應(yīng)4oC 靜置40min 以上以充分去除油脂。(3)0.5mL組織勻漿液獲得的蛋白足以進(jìn)行幾十次Western Blot。保證每0.5mL 組織勻漿液加入2 倍體積的(1 mL)抽提試劑是成功的關(guān)鍵。

3. 10,000×g4oC 離心10分鐘，溶液分為上下兩相，兩相中間為蛋白膜。吸除上層液體；隨后用吸頭或針頭輕輕撥開(kāi)蛋白膜，吸除下層液體。蛋白膜將附著于離心管壁。注意：(1)離心速度過(guò)高將使蛋白膜過(guò)于堅(jiān)固，難以溶解。(2)如果不 能分相，可再加入50μl 蒸餾水混勻離心.(3)如果初始組織量較少(<10mg)，離心后難以得到完整的蛋白膜，此時(shí)可吸去上下層液體，加入1mL 純乙醇混勻，10,000 ×g 4oC 離心3 分鐘。棄所有液體，蛋白沉淀在管底。

4. 敞開(kāi)管口，室溫空氣干燥沉淀。未溶解的蛋白沉淀不含鹽、去垢劑、和還原劑成分，可4oC或－20oC一年以上。

培養(yǎng)細(xì)胞蛋白提取 (參見(jiàn)固體組織蛋白提取程序中的斜體字注解)

1. 消化洗滌并800g離心收集細(xì)胞。每5-10×106細(xì)胞加入0.5mL裂解液，振蕩重懸，4oC凈置2分鐘。

2. 按比例每0.5mL裂解液加入1mL抽提試劑，振蕩混勻。4oC 靜置10min。

3. 10,000g4oC 離心10分鐘，溶液分為兩相，兩相中間為蛋白膜。小心吸除上層相和大部分下層相，保留兩相中間的蛋白絮狀物。如果不能分相，可再加入50μl蒸餾水混勻離心。

4. 加入1mL純乙醇洗滌沉淀。10,000g4oC 離心3分鐘，蛋白沉淀在管底。

5. 去除管中所有液體，敞開(kāi)管口，室溫空氣干燥蛋白沉淀。未溶解的蛋白沉淀不含鹽、去垢劑、和還原劑成分,可4oC或－20oC一年以上。

說(shuō)明

1. 按照上述提取和溶解過(guò)程，不加蛋白酶抑制劑，而蛋白不會(huì)有明顯降解，用戶不必(但可以)加入蛋白酶抑制劑。

2. 蛋白定量。注意使SDS濃度稀釋到不影響蛋白定量的水平，或選擇不受SDS影響的BCA定量方法.BCA法<5%SDS濃度,Bradford法<0.125%SDS濃度。

3. 按比例可進(jìn)行大規(guī)模的(多至1g)組織蛋白提取。

4. 提取試劑對(duì)眼睛和呼吸系統(tǒng)有一定刺激性，皮膚不慎接觸可用水清洗。